Produtos

Para cuantificar especificamente varios metabolitos de 5-fluorouracilo (5-FU) e dous nucleótidos de monofosfato endóxeno, desenvolvemos un método orixinal baseado nunha cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).Este ensaio permitiu determinar: (i) a produción intracelular de 5-fluoro-2′-desoxiuridina-5′-monofosfato (5-FdUMP) a partir de 5-FU ou 5-fluoro-2′-desoxiuridina (5-FdUrd) , (ii) o impacto da concentración de 5-FdUMP na relación intracelular 2′-desoxiuridina-5′-monofosfato (dUMP)/timidina-5′-monofosfato (TMP) e (iii) a extensión da secreción de 5-FdUMP e 5-FU de células humanas cultivadas por transportadores ABC.Nas nosas condicións experimentais, as células foron incubadas con 5-FU ou 5-FUrd.Despois, as proteínas celulares foron precipitadas por metanol.Este procedemento proporcionou unha alta recuperación da extracción.Ademais, para medir a secreción de 5-FU e 5-FdUMP das células, realizamos a cuantificación destas moléculas en medio de cultivo.Os medios foron inxectados directamente (5-FU) ou foron sometidos a unha extracción en fase sólida usando o cartucho de extracción Oasis Wax (5-FdUMP).A separación dos analitos realizouse nunha columna dC18 Atlantis 3,5 μm, (100 mm × 2,1 mm id) con modo isocrático usando tampón de formiato de amonio/metanol/auga (5/5/90, v/v) como fase móbil.O tempo de execución non superou os 6,2 min.Os analitos ionizáronse nunha interface de electrospray en modo de ión negativo.Validamos o método nun intervalo de 2,5-150 ng mL -1 segundo os compostos.A variabilidade intra e inter-ensaio foi inferior ao 10% durante sete días.Todos os compostos foron estables nas células ou no medio de cultivo cando as mostras foron almacenadas a -20 °C durante polo menos dúas semanas e despois de tres ciclos de conxelación-descongelación.Non se observou ningún efecto matricial en ambos os medios.