Produtos

As células eucariotas conteñen un delicado equilibrio de cantidades diminutas dos catro desoxirribonucleósidos trifosfatos (dNTPs), suficientes só para uns minutos de replicación do ADN.Tanto a deficiencia como o excedente dun só dNTP poden producir un aumento das taxas de mutación, unha reparación defectuosa do ADN ou un esgotamento do ADN mitocondrial.Os dNTP adoitan cuantificarse mediante un ensaio enzimático no que a incorporación de dATP radioactivo (ou dTTP radioactivo no ensaio de dATP) en oligonucleótidos sintéticos específicos por parte dunha ADN polimerase é proporcional á concentración do dNTP descoñecido.Descubrimos que a ADN polimerase de Klenow que se usa habitualmente pode substituír o ribonucleótido correspondente polo dNTP descoñecido, levando nalgúns casos a unha gran sobreestimación dos dNTP.Agora describimos as condicións de ensaio para cada dNTP que evitan a incorporación de ribonucleótidos.Para os ensaios de dTTP e dATP abonda con minimizar as concentracións do encima Klenow e do dATP marcado (ou dTTP);para dCTP e dGTP tivemos que substituír o encima Klenow pola ADN polimerase Taq ou pola termosequenase.Suxerimos que nalgúns informes anteriores a incorporación de ribonucleótidos puido causar valores demasiado altos para dGTP e dCTP.