Produtos

Novo ensaio de cromatografía líquida de alto rendemento para glicosiltransferases baseado na derivatización con ácido antranílico e detección de fluorescencia.

Os ensaios foron desenvolvidos usando a química única de etiquetaxe do ácido 2-aminobenzoico (2AA; ácido antranílico, AA) para medir as actividades tanto da β1-4 galactosiltransferase (GalT-1) como da α2-6 sialiltransferase (ST-6) mediante un líquido de alto rendemento. cromatografía (HPLC) con detección de fluorescencia (Anumula KR. 2006. Avances nos métodos de derivatización de fluorescencia para a análise cromatográfica líquida de alto rendemento de carbohidratos de glicoproteínas. Anal Biochem. 350:1-23).Utilizáronse como aceptores a N-acetilglucosamina (GlcNAc) e a N-acetillactosamina e o difosfato de uridina (UDP)-galactosa e o ácido N-acetilneuramínico (NANA) de citidina monofosfato (CMP) como doadores de GalT-1 e ST-6, respectivamente.Os produtos enzimáticos foron marcados in situ con AA e separáronse dos substratos na columna TSKgel Amide 80 en condicións de fase normal.As unidades enzimáticas determináronse a partir das áreas de pico en comparación cos estándares derivados concomitantemente Gal-β1-4GlcNAc e NANA-α2-6 Gal-β1-4GlcNAc.Establecéronse a linealidade (tempo e concentración enzimática), a precisión (intra e interensaio) e a reproducibilidade dos ensaios.Os ensaios resultaron útiles para controlar as actividades enzimáticas durante o illamento e a purificación.Os ensaios foron moi sensibles e realizaron igual ou mellor que as medicións tradicionais baseadas en azucres radioactivos.O formato de ensaio tamén se pode usar para medir a actividade doutras transferases, sempre que os aceptores de carbohidratos conteñan un extremo redutor para a etiquetaxe.Desenvolveuse un ensaio de aceptores de glicoproteínas mediante IgG.Desenvolveuse un curto método de perfilado por HPLC para a separación de glicanos IgG (biantenarios G0, G1, G2, mono e disialilados), que facilitou a determinación das actividades GalT-1 e ST-6 de forma rápida.Ademais, este método de perfilado debería resultar útil para controlar os cambios nos glicanos IgG en contextos clínicos.