Produtos

Comprender o metabolismo do hóspede microbiano é esencial para o desenvolvemento e optimización de procesos biocatalíticos baseados en células enteiras, xa que dita a eficiencia da produción.Isto é especialmente certo para a biocatálise redox onde se empregan células metabólicamente activas debido á capacidade de rexeneración do cofactor/cosubstrato endóxeno no hóspede.Utilizouse a Escherichia coli recombinante para a sobreprodución de prolina-4-hidroxilase (P4H), unha dioxixenase que cataliza a hidroxilación da L-prolina libre en trans-4-hidroxi-L-prolina con a-cetoglutarato (a-KG) como cosubstrato.Neste biocatalizador de células enteiras, o metabolismo central do carbono proporciona o cosubstrato necesario a-KG, acoplando o rendemento biocatalítico de P4H directamente ao metabolismo do carbono e á actividade metabólica.Ao aplicar ferramentas de bioloxía experimental e computacional, como a enxeñaría metabólica e a análise de fluxo metabólico (13)C ((13)C-MFA), investigamos e describimos cuantitativamente a resposta fisiolóxica, metabólica e bioenerxética do biocatalizador de células enteiras. á bioconversión dirixida e identificou posibles pescozos de botella metabólicos para unha maior enxeñaría de vías racionais. Construíuse unha cepa de E. coli deficiente na degradación da prolina eliminando o xene putA que codifica a prolina deshidroxenase.As biotransformacións de células enteiras con esta cepa mutante levaron non só á hidroxilación cuantitativa da prolina senón tamén a unha duplicación da taxa de formación específica de trans-4-L-hidroxiprolina (hyp), en comparación co tipo salvaxe.A análise do fluxo de carbono a través do metabolismo central da cepa mutante revelou que o aumento da demanda de a-KG para a actividade de P4H non mellorou o fluxo xerador de a-KG, o que indica unha operación do ciclo de TCA estrictamente regulada nas condicións estudadas.Na cepa de tipo salvaxe, a síntese e a catálise de P4H provocaron unha redución do rendemento de biomasa.Curiosamente, a cepa ΔputA compensou adicionalmente a perda asociada de ATP e NADH reducindo as demandas de enerxía de mantemento a taxas de absorción de glicosa comparativamente baixas, en lugar de aumentar a actividade do TCA. ser prometedor para a catálise produtiva de P4H non só en termos de rendemento de biotransformación, senón tamén en canto ás taxas de biotransformación e captación de prolina e o rendemento de hyp na fonte de enerxía.Os resultados indican que, tras un knockout de putA, o acoplamento do ciclo TCA á hidroxilación da prolina a través do cosubstrato a-KG convértese nun factor clave de restrición e nun obxectivo para mellorar aínda máis a eficiencia das biotransformacións dependentes de a-KG.