Produtos

A forma en que os efectos das mutacións simultáneas se combinan para cambiar a actividade enzimática non é facilmente previsible porque estes efectos non sempre son aditivos de forma lineal.Polo tanto, a caracterización dos efectos das mutacións simultáneas dos residuos de aminoácidos que se unen ao substrato pode facer unha contribución significativa á comprensión da especificidade do substrato dos encimas.Na beta-glicosidase de Spodoptera frugiperda (Sfbetagly), ambos os residuos Q39 e E451 interactúan co substrato e isto é esencial para definir a especificidade do substrato.Os dobres mutantes de Sfbetagly (A451E39, S451E39 e S451N39) preparáronse mediante mutaxénese dirixida ao sitio, expresados ​​en bacterias e purificados mediante cromatografía de afinidade.Estes encimas caracterizáronse utilizando p-nitrofenil beta-galactósido e p-nitrofenil beta-fucósido como substratos.A relación k cat/Km para mutantes simples e dobres de Sfbetagly que conteñen mutacións dirixidas ao sitio nas posicións Q39 e E451 utilizouse para demostrar que o efecto sobre a enerxía libre de ESdouble puñal (complexo de estado de transición enzimática) das dobres mutacións (Gdouble). daggerxy) non é a suma dos efectos resultantes das mutacións individuais (Gdouble daggerx e Gdouble daggery).Esta diferenza en Gdouble dagger indica que os efectos das mutacións únicas se solapan parcialmente.Polo tanto, este efecto común só conta unha vez en Gdouble daggerxy.Os datos cristalográficos das beta-glicosidases revelan a presenza dun enlace de hidróxeno bidentado que inclúe os residuos Q39 e E451 e o mesmo grupo hidroxilo do substrato.Polo tanto, tanto os datos termodinámicos como os cristalográficos suxiren que os residuos Q39 e E451 exercen unha influencia mutua nas súas respectivas interaccións co substrato.